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壮乡源对血管内皮细胞的保护作用研究

时间:2012年12月06日 来源:本站原创 作者:秦秋华 施晓霞 蒋伟哲 周燕* 浏览:

   

山麦胶囊(壮乡源)血管内皮细胞的保护作用研究

秦秋华 施晓霞 蒋伟哲 周燕*

(广西医科大学药学院  南宁 530021

摘要:目的 观察山麦胶囊脐静脉内皮细胞(HUVECs)的保护作用。方法 不同浓度的山麦胶囊含药血清培养HUVECs 24h,测定培养液中一氧化氮合酶(eNOS)活性和一氧化氮(NO)含量用肿瘤坏死因子TNF-α)诱导损伤HUVECsELISA法测定损伤模型组和含药血清组培养液中血管细胞粘附分子-1VCAM-1)和细胞间粘附分子-1ICAM-1)的含量。结果 含药血清组HUVECseNOS活性和NO含量显著升高P0.05;与模型组相比,含药血清组细胞形态无明显损伤,同时VCAM-1ICAM-1的含量水平明显下降P0.05结论 山麦胶囊能够增加HUVECseNOS的活性,使NO生成增多,抑制 VCAM-1ICAM-1生成,对血管内皮细胞具有保护作用

关键词山麦胶囊;脐静脉内皮细胞;TNF-αVCAM-1ICAM-1

Regression of Atherosclerosis by Shanmai Capsules in Vitro

Qin QiuhuaJiang WeizheShi XiaoxiaChen ZhaoniQin FeizhangZhou Yan.

Department of Pharmacology Guangxi Medical UniversityNanning 530021China

AbstractObjective To observe the protective action of shanmai capsules on human umbilical vein endothelial cellsHUVECs.Methods  Routine culture HUVECs with different concentrations of shanmai capsules containing serum 24h, measured the level of nitric oxide(NO) and endothelial nitric oxide synthase(eNOS) in cell culture fluid. Tumor necrosis factor-α(TNF-α) was used to induce inflammatory responses in HUVECs, then HUVECs were co-incubated with different concentrations of shanmai capsules containing serum, measured the level of vascular cellular adhesive molecular-1 (VCAM-1) and intercellular cellular adhesive molecules-1 (ICAM-1) in cell culture fluid by ELISA. Results Compare with model control group, the shape of HUVECs in shanmai capsules containing serum group had not changed, and shanmai capsules containing serum not only increased activities of eNOS and content of NO in HUVECs obviouslyP0.05, but also reduced the content of VCAM-1 and ICAM-1 at the same timeP0.05.Conclusion  Shanmai capsules could increase eNOS activities in HUVECs, rusult in produced more NO, and also inhibited the production of VCAM-1 and ICAM-1, showed that shanmai capsules could be used as an alternative in the

基金项目:广西科学基金 桂科自 0991264

*通讯作者:周燕(1975-),女,江苏无锡人,副教授,博士,研究方向为神经药理及心血管药理。Tel0771-5358272    email:zhouytl@yahoo.com.cn

 

treatment of chronic inflammatory diseases such as atherosclerosis.

Key wordsshanmai capsules; human umbilical vein endothelial cells; TNF-αVCAM-1ICAM-1

动脉粥样硬化AtherosclerosisAS是由于动脉壁受损致使脂质沉积,从而造成动脉血管管腔狭窄闭塞、全身重要器官缺血缺氧的危害严重的疾病 [1,2]。目前已知AS斑块的形成与血管内皮细胞受损密切相关[3],内皮细胞受损,使得内皮细胞与单核细胞的黏附性增强,促进单核细胞转变为巨噬细胞摄取脂质,最终形成脂质斑块。山麦胶囊(壮乡源)是一种以龙眼参为主要配方原料,对高血脂症、冠心病具有显著疗效的药物。龙眼参的黄酮类和皂苷类成分是作用于心血管系统的主要有效成分[4]。我们的前期研究也证实,复方龙眼参散(即山麦胶囊)能使AS鹌鹑模型的病变程度明显减轻[12]。本实验旨在进一步观察山麦胶囊药物成分血管内皮细胞的影响探讨其抗AS的机制是否与保护内皮细胞有关

1 材料和方法

1.1 动物及细胞株  健康雄性SD大鼠,体重(180±20g由广西医科大学医学实验动物中心提供,动物合格证号:SCXK2009–0002。脐静脉内皮细胞株(HUVECs),由广西医科大学药学院提供。

1.2 药物与试剂  山麦胶囊(由万博体育manbetx登录提供,批号:20090605专利号:201010576809.0);辛伐他汀(山德士中国制药有限公司,批号SK005);RPMI1640培养液、胎牛血清和胰酶(1:250)(美国Hyclone公司);肿瘤细胞坏死因子-αTNF-α)、内皮细胞生长因子(美国Sigma公司);一氧化氮NO)检测试剂盒(江苏碧云天生物技术研究所);诱导型一氧化氮合酶(eNOS)检测试剂盒(南京建成生物有限公司);VCAM-1 ELISA检测试剂盒、ICAM-1 ELISA检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.3 仪器  二氧化碳培养箱CL17R型低温离心机、MK3型酶联免疫检测仪(美国Thermo公司);超净工作台(苏州净化设备公司);XD-101倒置相差显微镜(南京江南光电集团股份有限公司);722sp可见分光光度计(上海棱光技术有限公司)。

1.4 含药血清的制备 根据标准动物的等效剂量折算系数法[1]换算等效剂量,山麦胶囊按成人用量的3倍剂量为大鼠灌胃给药的低剂量,6倍、12倍剂量为中、高剂量,将山麦胶囊用超纯水分别配制成22.5mg/ml, 45mg/ml, 90mg/ml三个剂量溶液。将SD大鼠随机分为5组,分别为山麦胶囊高、中、低剂量的含药血清组、阳性药对照组(辛伐他汀组,0.4 mg/ml)和正常血清组(生理盐水组),每组6只,按0.02ml/g体重灌胃给药,每天2次,连续3天。于末次给药后1h采用水合氯醛腹腔注射麻醉,腹主动脉采血,室温静置4h低温离心机43000rmin离心10min,分离血清。合并同组血清,56灭活30min0.22μm微孔滤膜过滤除菌,置于-20保存待用。

1.5 实验方法

1.5.1 细胞培养   将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)置于混有2mmol/L L-谷氨酰胺、100μg/ml肝素、100U/ml青霉素、100U/ml青霉素、30μg/ml内皮细胞生长因子和10%胎牛血清RPMI1640培养液中,在375%CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养。

1.5.2 含药血清对HUVECNOeNOS的影响  待细胞处于对数生长期后,用0.25%胰酶消化并收集细胞。用RPMI1640培养液(含10%胎牛血清)制成细胞悬液,镜下细胞计数,调整细胞密度为1×105个,接种于96孔培养板中,每孔100μl。待细胞贴壁稳定后,弃掉原来的培养液,PBS清洗2次,除空白组外其余各组加入含有10%含药血清的RPMI1640培养液常规培养24h。实验共分5个组,分别为山麦胶囊高、中、低剂量组,正常血清组,空白对照组。常规培养24h后收集细胞上清液低温离心,置于-20保存待测

1.5.3 TNF-α诱导HUVECs合成分泌VCAM-1ICAM-1的影响  处于对数生长期的HUVECs含有10%胎牛血清的RPMI1640培养液制成细胞悬液,镜下细胞计数,调整细胞密度为1×105个,接种于96孔培养板中,每孔100μl。待细胞贴壁稳定后,弃掉原来的培养液,PBS清洗2次,加入不含血清的RPMI1640培养液,除空白组外其余各组加入终浓度为10ng/mlTNF-α刺激6hPBS清洗2次。除空白组和模型对照组外其余各组用含有10%含药血清的RPMI1640培养液培养24h。实验共分为7个组,分别为山麦胶囊高、中、低剂量组,辛伐他汀血清组,正常血清组,模型对照组,空白组。培养24h后收集细胞上清液低温离心,置于-20保存待测

1.6 细胞培养上清液生化指标的检测   用硝酸还原酶法测定方法1.5.2中收集所得培养液中NO含量、eNOS活性,操作步骤分别按照NOeNOS试剂盒说明书进行;用ELISA法测定方法1.5.3中收集所得培养液中VCAM-1ICAM-1含量,操作步骤分别按照VCAM-1ICAM-1试剂盒说明书进行

1.7 统计学方法  采用统计软件SPSS13.0处理,计量资料均以均数±标准差( )表示。计量资料组间比较采用单因素方差分析,以P0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 山麦胶囊含药血清对正常HUVECs的影响  用山麦胶囊含药血清常规培养HUVECs 24h后,山麦胶囊高剂量组和中剂量组培养上清液中NO含量显著增加,与空白对照组比较,差异有统计学意义(P0.01);而含药血清低剂量组培养上清液中NO水平与空白对照组相比有升高趋势,但无统计学意义。与空白对照组相比,山麦胶囊含药血清高、中、低剂量组均能显著提高细胞培养上清液中的eNOS活性,差异有统计学意义(P0.05)。各组培养液中NOeNOS含量比较详见表1

1 山麦胶囊含药血清对HUVECs NOeNOS的影响 ,n=8

组别               NOμmol/L              eNOSU/ml        

空白对照组           16.74±3.18                 0.625±0.134     

正常血清组           19.08±3.45                 0.669±0.110     

高剂量组             34.54±2.86**               0.869±0.097**     

中剂量组             25.43±3.14**               0.773±0.052**     

低剂量组             20.19±2.58                         0.698±0.082       

注:与空白对照组比较,P<0.05**P<0.01

2.2 山麦胶囊含药血清对TNF-α诱导HUVECs形态学变化的影响    没有加入TNF-α之前,HUVECs胞体充盈,胞浆丰富,细胞边界清楚,胞体形态呈梭形或多角形,呈铺路石状排列。加入TNF-α之后,细胞形态发生明显改变:皱缩、变形,胞浆浓缩并出现颗粒状,细胞间隙增大,折光度暗,细胞无增值现象,细胞数量减少。用含药血清处理后发现,辛伐他汀组和高剂量组细胞边界清楚,形态没有出现明显皱缩、变形;中、低剂量组有部分细胞皱缩、变形;正常血清组及模型对照组细胞胞浆浓缩并出现颗粒状,细胞间隙增大,变形严重(详见图1

2.3 山麦胶囊含药血清对TNF-α诱导HUVECs合成分泌VCAM-1ICAM-1的影响    ELISA法测定,没有加入TNF-α的空白组(即没有含药血清及TNF-α处理过)VCAM-1ICAM-1仅为868 pg/ml945 pg/ml。用TNF-α 10ng/ml刺激6h后,VCAM-1ICAM-1的表达急剧增高P0.01,其含量水平分别增加了253.4%和244.8%。方差分析表明,与模型对照组相比,用不同浓度的山麦胶囊含药血清处理后,培养液中的VCAM-1ICAM-1水平均明显下降,并呈剂量依赖性,其中高、中剂量组培养液中VCAM-1ICAM-1含量显著低于模型对照组(P0.01)。说明山麦胶囊含药血清对由TNF-α诱导的HUVECs分泌产生VCAM-1ICAM-1有抑制

 

 

 

 

 

 

 

5s

作用,其中山麦胶囊含药血清高剂量和中剂量对VCAM-1ICAM-1的抑制率分别达到了42%41.6%29.3%27.7%各组培养液中VCAM-1ICAM-1含量比较详见表2

 

2 各组培养液中VCAM-1ICAM-1含量比较 , n=8

组别             VCAM-1pg/ml          ICAM-1pg/ml        

空白组               868±193                  945±103

模型对照组           3068±269                 3259±292

正常血清组           2842±218                 2993±279

辛伐他汀组           1688±205**               1775±190**

高剂量组             1779±194**               1903±162**

中剂量组             2168±314**               2353±232**

低剂量组             2801±374                        2918±282

注:与模型对照组比较,P<0.05**P<0.01


 

壮乡源对血管内皮细胞的保护作用研究          壮乡源对血管内皮细胞的保护作用研究                                                 

A. 正常组胞体充盈,胞浆丰富,细胞没有出现                     B. 模型对照组胞浆浓缩并出现颗粒状,细

皱缩,变形。                                             胞间隙增大,皱缩,变形,细胞数量急剧少。


壮乡源对血管内皮细胞的保护作用研究     壮乡源对血管内皮细胞的保护作用研究

C. 正常血清组胞浆浓缩并出现颗粒状,细胞间隙增大,                  D. 辛伐他汀组细胞没有出现严重皱缩,变形。      

出现皱缩,变形。                                                                                   

壮乡源对血管内皮细胞的保护作用研究         壮乡源对血管内皮细胞的保护作用研究

E. 山麦胶囊(高)组细胞边界清楚,                        F. 山麦胶囊(中)组细胞出现颗粒状,

没有出现严重皱缩,变形。                                                           部分细胞皱缩,变形。

壮乡源对血管内皮细胞的保护作用研究

G. 山麦胶囊(低)组细胞胞浆浓缩并出现颗

粒状,细胞间隙增大,出现皱缩,变形。

1  山麦胶囊含药血清对TNF-α诱导HUVECs分泌VCAM-1ICAM-1的影响(倒置相差显微镜,10×10

 

3 讨论

我们在动脉粥样硬化鹌鹑模型上做的前期研究已证实,复方龙眼参散(即山麦胶囊)可通过抑制平滑肌细胞增生,保护血管,减轻动脉粥样硬化(AS的程度[12]AS斑块的形成与血管内皮细胞受损密切相关,而内皮细胞是人体最大的合成和分泌NO的器官[3]NO水平降低被认为是内皮功能受损的主要特征[5]所以体内维持一定量的NO水平对内皮细胞来说是重要的内源性保护物质。NO在抑制平滑肌细胞增生[11]扩张血管,调节血压,抑制单核细胞黏附和黏附分子VCAM-1ICAM-1合成[49],以及保护血管壁内皮细胞不受损伤等方面起到重要作用。因此通过检测内皮细胞中NO的水平及血管细胞粘附分子-1VCAM-1)和细胞间粘附分子-1ICAM-1的表达可以为药物对内皮细胞的保护作用提供依据。

本实验观察了山麦胶囊对体外培养脐静脉内皮细胞eNOSNO的影响,结果发现含药血清显著增加细胞培养液中eNOS的活性(P0.05),从而促进NO的合成,增加NO的浓度P0.01目前已知的一氧化氮合酶主要有诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)两种[6]iNOS主要分布在心肌细胞和白细胞内,平时不表达,只有当细胞损伤时才会处于高表达状态[7] eNOS主要在动、静脉内皮细胞和肾小管上皮细胞上表达,是内皮细胞合成NO的唯一限速酶,因此增加体内eNOS活性可促进NO合成[8]

我们的实验结果还显示,TNF-α处理后内皮细胞间隙增大、皱缩、变形、损伤明显,而山麦胶囊可减轻TNF-αHUVECs损害,含药血清组细胞形态较模型对照组及正常血清组明显改善。本实验还观察了山麦胶囊对内皮细胞VCAM-1ICAM-1分泌量的影响。黏附分子VCAM-1ICAM-1AS早期病变的形成过程中起重要作用:一方面可促进血管平滑肌细胞增殖加重动脉血管管腔再狭窄过程[9];另一方面当正常情况下处于低表达或不表达状态的粘附分子VCAM-1ICAM-1,在受到TNF-αIL-1氧化脂蛋白等刺激后,变成高表达状态,促进血液中的单核细胞与血管内皮细胞的黏附,单核细胞迁移到内皮下转化为巨噬细胞后可摄取脂质转变为泡沫细胞,泡沫细胞最终可因吞入过多脂质而破裂,使脂质进入细胞外,最终形成细胞外脂质斑块[10]我们的实验结果显示,山麦胶囊显著下调内皮细胞VCAM-1ICAM-1的分泌量P0.01)。这表明,山麦胶囊可以通过抑制AS早期病变的第一个始动环节,即通过生成NO,抑制VCAM-1ICAM-1生成,阻止单核细胞和内皮细胞的黏附,发挥对血管内皮细胞的保护作用

本文细胞培养实验及我们在前期动物模型实验[12]中所得出的结论表明,山麦胶囊的AS作用与其阻止单核细胞黏附和保护血管内皮细胞的效应密切相关,这将为治疗AS提供一条新思路,最终为其临床治疗动脉粥样硬化提供有力依据。但是,山麦胶囊AS的深层机理还需我们从分子、基因水平作进一步更深入的研究。

参 考 文 献

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(致谢:在本论文的完成过程中,得到蒋伟哲教授在课题设计、实施、资料分析和论文写作过程中的指导和帮助,使我们顺利的完成了本研究工作,在此表示深深的谢意!

 

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