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壮乡源对肾性高血压降压作用的研究

时间:2012年12月06日 来源:本站原创 作者:秦秋华1,周 燕1* ,蒋伟哲1,施晓霞1,龙凤鸣2,韦秀芝2 浏览:

   

山麦胶囊(壮乡源)对肾性高血压大鼠降压作用的研究*

秦秋华1,周 燕1* ,蒋伟哲1,施晓霞1,龙凤鸣2,韦秀芝2

1.广西医科大学药学院  南宁 5300212.河池市第一人民医院 河池 546300

摘要:目的  观察山麦胶囊对用“两肾一夹”法制备的肾性高血压大鼠血压的影响。方法  采用“两肾一夹”法制备肾性高血压大鼠模型,并用无创血压测量系统筛选出造模成功的大鼠,随机分为5个组,分别为模型对照组、山麦胶囊高、中、低剂量组及阳性对照组卡托普利组,另设一个正常对照组,共6组,连续给药4周。于造模前、造模后和给药4周末测量大鼠血压,并于第4周末采集的大鼠血浆和心脏组织标本,测定血浆中的一氧化氮(NO)、血管紧张素AngⅡ)和内皮素(ET)含量,用精密天平称量全心重量(HW)、左心室重量(LVW),应用病理学方法测定心肌纤维直径(MD)的重塑指标。结果  山麦胶囊的高剂量能显著降低肾性高血压大鼠的血压和血浆中AngET含量及MDP0.01,同时增加NO的含量P0.05结论  山麦胶囊对肾性高血压大鼠有降压作用,抑制心肌肥大的形成,其机制可能是通过降低体内的内源性缩血管物质水平来达到降压效果。

关键词山麦胶囊;两肾一夹;肾性高血压;一氧化氮;心肌肥大

To Study the Antihypertensive Effect of Compound Longyanshen in renovascular Hypertensive Rats  

Qin Qiu-hua1, Zhou Yan1*, Jiang Wei-zhe1, Shi Xiao-xia1, Long Feng-ming2, Wei Xiu-zhi2.

1 Department of Pharmacology, Guangxi Medical University, Nanning 530021, China2 Hechi First People,s Hospital, Hechi, 546300, China

Abstract Objective  To abserve the effects of compound longyanshen on blood pressure in renovascular hypertensive rats by two–kidney one–clipmethod.  Methods  Established renovascular hypertensive model in rats by two–kidney one–clipmethod, and choose the rats of model successed by noninvasive blood pressure measurement system, randomly divided into model group, compound longyanshen (high) (middle) (low) dose group, captopril group and control group, gave them drugs for four weeks. Measured the blood pressure of rats at before, after modeling and delivery four weeks. Collect plasma and heart specimens of rats in the fourth weekend, determinat the level of nitric oxideNO, angiotensin Angand endothelinET,and weighting the heart weightHWand left ventricular weightLVW, measure remodeling of myocardial fiber diameterMDby pathologically method.  Results  compound longyanshen with high dose can reduce the blood pressure and myocardial fiber diameter and the level of angiotensin and endothelin of renovascular hypertensive rats obviouslyP0.01, increase nitric oxide at the same timeP0.05.  Conclusion  compound longyanshen can lower the blood pressure of renovascular hypertensive rats, inhibit the formation of myocardial hypertrophy, and its mechanism may be related to lower level of endogenous shrink vascular material in the rats.

龙眼参是蝶形花科植物疏叶芽豆(Millettia pulchra Kurz var.laxior Dunn Z.wei)的块根,国内外药理研究表明龙眼参有促进造血、增强免疫功能、保护受伤肝组织、抗衰老、抗痴呆等广泛的药理作用[1]。查阅有关资料提示,龙眼参中的黄酮类和皂苷类成分为作用于心血管系统的主要有效成分[2],本实验旨在观察以龙眼参为主药的山麦胶囊(壮乡源)对用“两肾一夹”法制备的肾性高血压大鼠降压作用的研究。

1 材料和方法

1.1 药物与试剂  山麦胶囊生药粉末(万博体育manbetx登录,批号:20090605);卡托普利(山德士中国制药有限公司,批号:AK002);注射用生理盐水(昆明宇斯药业有限责任公司,批号:11010602);一氧化氮检测试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号:20110303血管紧张素ⅡELISA测定试剂盒(美国Rapidbio公司,批号:20110226Q);内皮素ELISA测定试剂盒(美国Rapidbio公司,批号:20110301B)。

1.2 实验动物  健康雄性SD大鼠,体重(180±20g由广西医科大学医学实验动物中心提供,动物合格证号:SCXK2009–0002

1.3 仪器  ALC–NIBP无创血压测定分析系统(上海澳尔科特生物技术公司);精密天平(梅特勒—托利多仪器上海有限公司);CL17R型低温离心机(美国Thermo公司);722sp可见分光光度计(上海棱光技术有限公司);MK3型酶联免疫检测仪(美国Thermo公司);DMRQ550病理图像分析仪(德国Leica公司)。

1.4 动物造模、分组及给药  健康雄性SD大鼠50只,适应性喂养一周,于造模前用ALC–NIBP无创血压测定分析系统测量各大鼠尾动脉血压,重复测量3次,取其平均值并记录。采用“两肾一夹”法制备肾性高血压大鼠模型[3]。造模四周后,筛选出收缩压(SP120mmHg造模后血压比造模前高20mmHg以上者为实验用肾性高血压鼠[4],共46只,随机分为5组,分别为模型对照组9只,阳性药对照组(卡托普利组)9只,山麦胶囊高剂量组9只,山麦胶囊中剂量组9只,山麦胶囊低剂量组9只;另设有假手术组10只(只游离单侧肾动脉,但不做缩窄,未形成高血压)。术后四周,待大鼠SP稳定后,于给药前再用ALC–NIBP无创血压测定分析系统测定大鼠清醒状态下的尾动脉血压。于第五周开始,每日固定时段各组同时灌胃给药1次,连续四周。灌服各种药物的剂量根据标准动物的等效剂量折算系数法换算等效剂量,模型对照组和假手术组大鼠灌以等量生理盐水,山麦胶囊高剂量组1.8gkg·d中剂量组0.9gkg·d,低剂量组0.45gkg·d,卡托普利组7mgkg·d

1.5 生化指标的检测

1.5.1 血压测定  于造模前、造模后第4周和给药4周末用ALC–NIBP无创血压测定分析系统测定大鼠清醒状态下的尾动脉收缩压(SP),重复测量3次,取其平均值

1.5.2 血清NO含量的测定  连续给药四周末,于最后一次给药后12h,经颈动脉插管取血,低温离心机44000rmin离心10min,分离血清,-80冰箱保存备用。用比色法测定NO实验步骤按NO检测试剂盒说明书操作。

1.5.3 血浆Ang含量的测定  血浆制备方法同上,但经EDTA抗凝后离心再分离血浆。酶联免疫法测定,实验步骤按Ang ELISA测定试剂盒说明书操作

1.5.4 血浆ET含量的测定  血浆制备方法同上。酶联免疫法测定,实验步骤按ET  ELISA测定试剂盒说明书操作

1.5.5 心肌纤维重塑指标的测定  处死大鼠取心脏,用精密天平称量全心重量(HW),剪除心房和右心室,保留左心室(含室间隔),称其重量(LVW),计算全心重量体重(HWBW)、左心室重量体重,即左心室重量指数(LVI)。在左心室长轴中点处垂直方向切取 34mm厚组织片,用中性甲醛固定,蜡块包埋,切成8μm厚的切片, HE染色,放大400倍,用光学显微镜和DMR+Q550图像分析仪观察切片,每张切片随机选取5个视野,测30个心肌纤维的直径(MD),取平均值。

1.5.6 采用统计软件SPSS13.0处理,计量资料均以均数±标准差( )表示。计量资料组间比较采用单因素方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 山麦胶囊对高血压模型大鼠血压的影响  造模前,大鼠的平均血压为106.34mmHg。造模四周后,大鼠的平均血压为151.26mmHg,与假手术组(108.72mmHg)比较,血压变化存在显著性差异(P0.01。给药四周后,山麦胶囊高剂量组、卡托普利组均产生明显的降压作用,与模型对照组比较有显著性差异(P0.01。配对t检验表明,与自身给药前后血压相比较,山麦胶囊高剂量组、卡托普利组存在显著性差异P0.01),提示山麦胶囊大剂量可显著降低血压,而中剂量降压效果不大,低剂量则对血压没有影响。实验期间各组大鼠血压变化参数见表1

1  各组大鼠实验期间血压值的变化情况( , mmHg)

组别                大鼠数

n

血压测定(mmHg

造模前          造模四周后     给药四周后

假手术组                      

模型对照组

卡托普利组

山麦胶囊(高)组

山麦胶囊(中)组

山麦胶囊(低)组

10                  106.70±7.86        108.72±7.74          107.91±7.66△△

8                 105.72±6.67              150.15±5.43        150.87±5.84

8          105.58±5.22        151.84±2.09      142.85±5.55**△△

8          107.08±5.86        151.83±1.97      141.52±6.04**△△

7          106.34±8.66        151.94±1.45      146.88±4.00

6          106.61±6.58        150.56±7.40      149.08±4.04

     

注:自身给药前后血压比较,**P<0.01与模型对照组血压比较,△△P<0.01

2.2 山麦胶囊对血清中NOAngⅡ和ET含量的影响  由表2可知,模型对照组大鼠AngⅡ和ET含量均较其他各组高。给药四周后,与模型对照组相比较,山麦胶囊高剂量组和卡托普利组均能显著降低高血压模型大鼠血浆中AngⅡ和ET的生成(P0.01),明显提高高血压模型大鼠血清中的NO含量(P0.01P0.05)。而山麦胶囊中剂量组和低剂量组均能不同程度的降低高血压模型大鼠血浆中AngⅡ和ET的生成,血清中的NO水平亦有所提高,但无明显统计学意义。各组NOAngET含量比较详见表2

2 山麦胶囊对高血压模型大鼠NOAngⅡET含量的影响( ,n9)

 

组别               NOμmolL     AngⅡngL        ET(pgml)

假手术组              36.71±8.31        555.26±106.25**       69.10±10.03**

模型对照组            25.31±4.93        981.93±174.45         169.69±27.15

卡托普利组            54.96±15.76**     639.57±150.79**       93.96±14.11**

山麦胶囊(高)组    40.76±13.76      642.28±153.39**       98.17±8.91**

山麦胶囊(中)组    35.14±3.20        736.35±167.54**       118.78±20.43**

山麦胶囊(低)组    34.78±14.35       847.76±64.24          126.65±17.45**

      注:与模型对照组比较,P<0.05**P<0.01

2.3 山麦胶囊对高血压模型大鼠心肌肥大模型的影响  给药四周后,处死大鼠摘取心脏时发现,与假手术组比较,模型对照组大鼠的心脏体积增大,心室壁肌肉层变厚,山麦胶囊各给药组心室壁肌肉层较模型对照组要薄。与模型对照组比较,山麦胶囊各剂量组和卡托普利组的HWBWLVI较模型对照组有所下降,但无统计学意义。400倍光学显微镜下观察发现,与假手术组相比,模型对照组大鼠的心肌细胞呈现肥大变化。心肌纤维纵切面上,胞浆染色加深,细胞核略增大、加长,心肌纤维变粗,直径(MD)变大。DMR+Q55O图像分析仪观察切片可知,模型对照组大鼠的MD显著高于其他各组,山麦胶囊高剂量组和卡托普利组MD则较模型对照组缩小。方差分析表明,山麦胶囊高剂量组和卡托普利组与模型对照组MD比较均存在显著性差异(P0.01),说明山麦胶囊高剂量组和卡托普利均能抑制高血压模型大鼠的心肌肥大,抑制幅度分别为37.95%、36.54%,山麦胶囊高剂量组抑制心肌肥大的作用更为明显。各组大鼠MD的比较见表3和图16

3 山麦胶囊对高血压模型大鼠心肌肥大模型的影响( ,n9)

组别              HWBWmgg     LVImgg      MD (μm)

假手术组              3.20±0.13            1.58±0.22**        9.08±0.62**

模型对照组            3.68±0.50            1.96±0.38△△        14.89±1.03△△

卡托普利组            3.58±0.53             1.82±0.07          9.45±0.66**

山麦胶囊(高)组    3.50±0.41             1.80±0.25          9.24±0.57**

山麦胶囊(中)组    3.54±0.49             1.85±0.22         10.38±0.41*△

山麦胶囊(低)组    3.81±0.26            1.85±0.26         11.92±1.01*△

      注:与模型对照组比较,P<0.05**P<0.01;与假手术组比较,P<0.05△△P<0.01

16 山麦胶囊对高血压模型大鼠MD的影响

壮乡源对肾性高血压降压作用的研究                壮乡源对肾性高血压降压作用的研究

心肌纤维细胞(纵切面,HE染色,40×10

1 假手术组心肌细胞呈扁平梭形状,细胞核呈                2 模型对照组心肌细胞呈现肥大变化,呈椭

类圆形,胞核略小。                                        圆形状,胞核略增大、增长,MD变大。

壮乡源对肾性高血压降压作用的研究                壮乡源对肾性高血压降压作用的研究          

3 山麦胶囊(高)组心肌细胞未见明显的肥               4 卡托普利组心肌细胞未见明显的肥大变化,

大变化,胞核较模型对照组略小,MD减小。                  胞核较模型对照组略小,MD减小。

 壮乡源对肾性高血压降压作用的研究                壮乡源对肾性高血压降压作用的研究  

5 山麦胶囊(中)组心肌细胞未见明显的肥大               6 山麦胶囊(低)组心肌细胞发生肥大作用,

变化。                                                     胞核增大,MD变大。

3 讨论

目前,主要常用于实验研究的高血压心肌肥厚动物模型有以下几种:①腹主动脉缩窄所致的压力负荷性高血压心肌肥厚模型:腹主动脉缩窄法是一种常用的心肌肥厚模型的制备方法之一。由于心肌肥厚的发生机制较为复杂,除增加心脏后负荷外,还受诸多因素的影响,如:血流动力学因素、肾素-血管紧张素系统以及神经一体液的调节等影响;②遗传性高血压动物模型:自发性高血压大鼠,Milan 种高血压大鼠及遗传性高血压大鼠等。理论上自发性高血压大鼠是最接近人类原发性高血压的动物模型。但价格昂贵,推广受到一定限制;③肾血管性高血压大鼠,两肾一夹型是实验中最常用的高血压模型制备方法。本实验建立的大鼠高血压左心室肥厚模型,就是通过U 型银夹钳夹大鼠左侧肾动脉,即2KlC 型肾血管性高血压大鼠模型,促使肾动脉的血流通过减少,导致肾脏缺血,调动体内负反馈调节,从而激活RAAS 系统,加重心脏的后负荷、导致动脉压升高及左心室肥厚。此模型的血压受血流动力学、神经-体液及RAAS 系统等因素的影响,与心肌肥厚的复杂机制比较吻合。此模型的特点是可操作性强、重复性好、造价低、模型稳定可靠。

本实验采用“两肾一夹”法制备肾性高血压大鼠模型,大鼠血压从造模后第二周开始稳定持久的上升,并在第四周达到稳定的高水平,与造模前相比,血压至少升高40mmHg,高血压形成率达96%,证明该模型的建立方法是成功的。

随着高血压病研究的发展,必然发现有更多的因素参与调控高血压。研究表明,血管内皮细胞分泌的内皮衍生舒血管因子一氧化氮(NO)是维持血管基础张力的主要血管活性物质。NO合成、释放失衡直接影响血管的基础张力[5]。而动脉血管壁NO浓度的降低是导致内皮血管功能损伤的重要原因,内皮细胞损伤后,血管通透性增大,大分子物质如低密度脂蛋白、胰岛素以及各种细胞生长因子进入血管壁,血管壁结构发生变化,导致血压升高,进而形成高血压[6]ET在正常情况下,可起到强烈收缩受损血管的作用,减少因血管受损引起的出血。ET是目前所知道的体内最强的血管收缩因子,缩血管作用比Ang10, 比去甲肾上腺素强1000倍。血管壁中含有较高浓度的血管紧张素转化酶(ACE,局部的ACE使AngⅠ转化为Ang,不仅直接影响血管平滑肌细胞收缩,而且可使内皮型一氧化氮合酶(eNOS)磷酸化,从而减少NO合成,介导ET生成增多。近年来研究表明,AngⅡ是介导牵张引起的心肌重构的重要物质,AngⅡ可通过AT1受体介导刺激心肌纤维细胞合成胶原蛋白,导致心肌细胞肥大[7]。因此,NOETAngⅡ和心肌肥大之间存在相互作用的关系,AngⅡ可介导ET的生成,而ET反过来又可诱导AngⅡ的产生[8]ETAngⅡ是相互促进的关系。而NO作为最重要的血管内皮舒张因子,对舒张血管平滑肌、扩张血管增大血流量具有极其重要的作用,NOETAngⅡ的拮抗效应的平衡是维持血管基础张力的关键。

本实验研究结果表明山麦胶囊能够降低肾性高血压大鼠的血压,与模型对照组相比,山麦胶囊给药组尤其是高剂量组血浆中的AngⅡ和ET含量、心肌纤维直径(MD)显著低于模型对照组(P0.01);另一方面,高剂量组血清中的NO含量与模型对照组比较差异有统计学意义(P0.05),说明山麦胶囊有提高大鼠体内的NO水平的趋势。

与促进内源性舒血管物质的生成相比,山麦胶囊在抑制内源性缩血管物质方面更为明显,提示山麦胶囊可能通过降低体内的内源性缩血管物质水平,进而降低肾性高血压大鼠的血压。血浆中含有AngⅡ、ET等血管活性物质可通过调节血管张力导致血管内膜肥厚和血管平滑肌肥厚,致使血管管腔变小,血流压力随之升高;另一方面,AngⅡ、ET参与调控心肌细胞,使之胶原基因的表达增强,心肌细胞胶原合成明显增加,致使心肌细胞发生肥大。山麦胶囊可通过降低体内内源性缩血管物质的水平,改善血管中膜间质纤维化,进而改善血管内膜肥厚,同时阻断细胞的胶原合成增加,改善心肌肥大和左室肥厚,进而保护心脏组织。随着对高血压的治疗研究的深入,山麦胶囊将为临床治疗提供一条新思路,对以后的高血压的治疗产生深远的影响。

参考文献

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(致谢:在本论文的完成过程中,得到蒋伟哲教授在课题设计、实施、资料分析和论文写作过程中的指导和帮助,使我们顺利的完成了本研究工作,在此表示深深的谢意!

 



* 广西科学基金项目 桂科自0991264

*通讯作者:周燕(1975-),女,江苏无锡人,副教授,博士,研究方向为神经药理及心血管药理。Tel0771-5358272    email:zhouytl@yahoo.com.cn